PolyShooter^TM INTERFERE

Transfection Reagent

For the transfection of siRNA/miRNA into animal cells

Catalog Number：P09410

01/產品概述

　　RNA干擾（RNAinterference，RNAi）是近年來生命科學領域十分重大的發(fā)現(xiàn)之一，它是指小分子雙鏈RNA可以特異性地降解同源mRNA，從而抑制或關閉特定基因表達的現(xiàn)象。人們只要知道了某種疾病的致病基因，就可以設計出針對該基因mRNA的小分子干擾RNA（SmallinterferingRNA，siRNA），抑制或封閉該致病基因的表達，從而達到治療疾病的目的。由于使用RNAi技術可以特異性剔除或關閉特定基因的表達，所以該技術已被廣泛用于探索基因功能和傳染性疾病及惡性腫瘤等基因治療領域。RNAi是目前尤為熱門的生命科學研究領域，也是未來有發(fā)展前途的新藥開發(fā)領域。除此之外，RNAi技術還可以廣泛應用于農業(yè)、林業(yè)、畜牧業(yè)和漁業(yè)等多種領域，進行良種培育、良種篩選和疾病治療等。

　　 siRNA/miRNA導入有以下幾種方法∶化學轉染技術、電穿孔法、磷酸鈣共沉淀技術、顯微注射和載體導入技術。由于電轉的方法對細胞損傷比較大，一般不建議選擇電轉。化學轉染技術是目前最為常用的方法，化學轉染能否成功的關鍵在于轉染試劑的選擇。

　　 PolyShooter siRNA/miRNA 轉染試劑 P09410，即PolyShooter INTERFERE Transfection Reagent是一種基于陽離子高分子聚合物的新型轉染試劑，適用于siRNA和miRNA的轉染。其原理為帶正電的高分子聚合物與siRNA/miRNA帶負電的磷酸基團形成帶正電的復合物后，與細胞表面帶負電的蛋白多糖相互作用，并通過內吞作用進入細胞，形成內含體。該轉染試劑具有質子海綿的作用，能夠吸收溶酶體中的H+，質子的不斷流入導致復合體腫脹破裂，從而使外源siRNA或miRNA釋放到細胞質中，實現(xiàn)siRNA/miRNA的細胞轉染。

　　PolyShooter siRNA/miRNA 轉染試劑 P09410 對多種常見細胞具有高水平轉染效率，具有高效低毒、操作簡單、重復性好等優(yōu)點，適用siRNA/miRNA介導的基因抑制實驗。其*的配方使其轉染后無明顯細胞毒性，因此無需去除轉染試劑-核酸復合物或更換新鮮培養(yǎng)基，也可根據(jù)具體情況優(yōu)化轉染體系。

02/產品組分

03/保存條件

冰袋（wetice）運輸。4℃保存，有效期6個月。-30℃至-10℃保存，有效期12個月，避免反復凍融。

04/產品特點

　　轉染效率高——針對廣泛類型的細胞，均表現(xiàn)出優(yōu)秀的轉染效率，基因抑制效果好，脫靶效應低

　　細胞毒性低——作用溫和，能較好地實現(xiàn)高轉染效率與低細胞毒性之間的平衡

　　適用范圍廣——可用于多種細胞類型，適合siRNA/miRNA介導的基因抑制實驗

　　操作簡單——簡單快速的實驗方案，可獲得穩(wěn)定的結果，且轉染后無需去除復合物或更換新鮮培養(yǎng)基

05/適用范圍

　　LeapWal PolyShooter siRNA/miRNA 轉染試劑是一種基于陽離子高分子聚合物的新型轉染試劑，適用于siRNA和miRNA的轉染。

06/實驗流程概要

07/實驗步驟（以24孔板為例，其他培養(yǎng)板加樣體積參考表一：轉染量度標準）

1: 準備待轉染細胞

貼壁細胞：轉染前一天，將胰酶消化后的細胞按照每孔0.1-1x10⁵個細胞的量進行鋪板，使其在轉染時密度為30%-40%。

懸浮細胞：轉染當天，配制轉染試劑-核酸復合物之前，在24孔板中進行細胞鋪板，每500 µL生長培養(yǎng)基中加入0.5-2.5x10⁵個細胞。

Ø 細胞狀態(tài)會極大影響轉染效率，待轉染細胞應處于良好生長狀態(tài)，建議使用生長處于指數(shù)期、存活率大于90% 的細胞進行轉染。

2: 準備PolyShooter^TM INTERFERE轉染試劑-核酸復合物

（1）取1 μL siRNA (20 μM，DEPC水溶解) 加入到1.5 mL離心管中，加入2 μL PolyShooter^TM INTERFERE轉染試劑與siRNA混合，室溫孵育3分鐘。

Ø 基因性質、細胞類型、siRNA效價、靶mRNA的半衰期和靶蛋白的周轉率等因素均會影響siRNA的轉染效率，建議選取siRNA作用濃度在10-100 nM之間，轉染試劑的體積應根據(jù)siRNA濃度和培養(yǎng)皿的大小進行調整，請參見表一。

（2）往上述混合物中加入100 μL Opti-MEMTM I減血清培養(yǎng)基（無血清無雙抗），輕輕混勻，在室溫下靜置30分鐘，形成轉染試劑-核酸復合物。

3: siRNA細胞轉染

30分鐘后，將上述100 µL轉染試劑-核酸復合物加入每孔細胞，輕輕搖動培養(yǎng)板混勻。

4. 分析轉染細胞的基因干擾效率

轉染細胞培養(yǎng)24-48小時后，可根據(jù)實際情況用RT-PCR、Western Blot、ELISA、熒光檢測法、流式細胞術、報告基因等檢測基因干擾效果，或進行后續(xù)功能實驗。

Ø 該轉染試劑也適合轉染miRNA，具體操作請參考siRNA的操作流程。

表一：轉染量度標準

08/注意事項

1.核酸質量：確保siRNA/miRNA是經過PAGE純化和脫鹽處理的，高純度的siRNA/miRNA有助于獲得較高的轉染效率。

2.細胞質量：細胞狀態(tài)會極大影響轉染效率，建議使用生長處于指數(shù)期、存活率大于90%的細胞進行轉染。

3.細胞密度：建議細胞傳代后12-24h內、細胞密度為30%-40%時進行轉染。不同的細胞轉染實驗，對細胞密度的要求不盡相同。在進行不同核酸或不同細胞系的轉染時，需要根據(jù)說明書再次優(yōu)化實驗條件。此外，在實驗過程中保證相同的接種條件，確保實驗數(shù)據(jù)的可重復性。

4. siRNA與轉染試劑使用比例：對于大多數(shù)細胞系而言，轉染復合物中siRNA (μL of 20 μM Stock)與PolyShooter^TM INTERFERE Transfection Reagent (μL) 的比例在1：1至1：3之間，推薦比例為1:2。想要獲得理想的基因干擾結果，需要對這一比例進行優(yōu)化，根據(jù)所轉染細胞及siRNA選擇適合的轉染比例。

5. 由于一些特殊培養(yǎng)基中的某些成分可能會抑制陽離子聚合物介導的轉染，因此有必要檢測特殊培養(yǎng)基與PolyShooterTM INTERFERE Transfection Reagent的相容性。

6. 轉染前，確保siRNA/miRNA基因沉默表達不會影響細胞活力。

7. 您需要設計針對目的基因的若干siRNA（小干擾RNA），并評估其效價。

8. 整個實驗過程使用無RNA酶和無熱原性的材料，如離心管、槍頭、緩沖液。

9. 為了您的健康安全，請規(guī)范操作，穿戴實驗服與手套開展實驗。

10. 本產品僅供科研使用，請勿用于臨床診斷及治療。

09/實驗案例分析

1: 轉染前一天，將穩(wěn)定表達GFP的HeLa細胞接種于24孔板，使其在轉染時密度為30%。

2: 按照每孔計量，取1μL siRNA(GFP/NC, 20 μM)加入到1.5 mL離心管中，再加入2 μL PolyShooterTM INTERFERE Transfection Reagent與siRNA進行混合，室溫孵育3 min。

3: 往上述混合物中加入100 μL Opti-MEM^TM I減血清培養(yǎng)基（不含血清不含雙抗），輕輕混勻，在室溫條件下靜置30 min，形成PolyShooter^TM INTERFERE轉染試劑-核酸復合物。

4: 30分鐘后，將上述100 µL轉染試劑-核酸復合物加入每孔細胞，輕輕搖動培養(yǎng)板混勻。

5: siRNA轉染細胞24小時后，用熒光顯微鏡及流式細胞儀檢測GFP綠色熒光蛋白干擾效果，實驗結果如圖2所示。

6: 說明：此次實驗選擇商業(yè)化的 siRNA轉染試劑RNAiMAX作為對照組，RNAiMAX的具體實驗操作按照其說明書進行。簡單來說：在不含抗生素的50 μL 無血清Opti-MEM 培養(yǎng)基中稀釋1μL siRNA(GFP, 20 μM)，輕輕混勻。然后，在不含抗生素的50 μL 無血清Opti-MEM 培養(yǎng)基中稀釋1μL RNAiMAX，輕輕混勻。將稀釋的siRNA與稀釋的RNAiMAX輕輕混合，在室溫下孵育20分鐘。將混合物添加到細胞中，其終體積為600μL。siRNA轉染細胞24小時后，用熒光顯微鏡及流式細胞儀檢測GFP綠色熒光蛋白干擾效果。

圖2: siRNA轉染細胞24 h后，熒光顯微鏡(A)及流式細胞儀(B)檢測GFP干擾效果

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