PolyShooter^TM

Transfection Reagent

Polymer Reagent For Transfecting Common Cell Lines

Catalog Number：P09110

01/產(chǎn)品概述

細(xì)胞轉(zhuǎn)染是指將外源分子導(dǎo)入真核細(xì)胞內(nèi)以改變其基因型或表型的一種技術(shù)。隨著分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)研究的不斷發(fā)展，轉(zhuǎn)染已經(jīng)成為研究和控制基因功能的常規(guī)手段，廣泛應(yīng)用于基因功能研究、調(diào)控基因表達(dá)、突變分析和蛋白質(zhì)生產(chǎn)等領(lǐng)域。轉(zhuǎn)染大致可分為物理介導(dǎo)、化學(xué)介導(dǎo)和生物介導(dǎo)三類途徑。其中化學(xué)介導(dǎo)方法因其兼具高效低毒、方便快捷等優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用廣泛。化學(xué)介導(dǎo)方法包括經(jīng)典的磷酸鈣共沉淀法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法以及多種陽離子物質(zhì)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法。

理想的細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法應(yīng)該具有轉(zhuǎn)染效率高、細(xì)胞毒性小等優(yōu)點(diǎn)。已有眾多文獻(xiàn)報(bào)道，脂質(zhì)體本身會(huì)參與細(xì)胞生理活動(dòng)，影響基因表達(dá)，對(duì)研究數(shù)據(jù)產(chǎn)生一定程度的干擾。同時(shí)，脂質(zhì)體會(huì)對(duì)目的細(xì)胞造成細(xì)胞毒性，這種毒性是由其脂質(zhì)特性決定的。市面上多種商業(yè)化的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑要求細(xì)胞鋪板密度較高，以90%-95%為佳，這有助于減少陽離子脂質(zhì)體細(xì)胞毒性造成的影響。但是，如果研究的基因要求比較長的表達(dá)時(shí)間，例如細(xì)胞周期相關(guān)基因，或者細(xì)胞表面蛋白，又或者轉(zhuǎn)染后續(xù)需要進(jìn)行繼續(xù)培養(yǎng)和功能研究，則不適合用脂質(zhì)體核酸轉(zhuǎn)染試劑。目前眾多的研究者和生物公司將新一代轉(zhuǎn)染試劑的開發(fā)聚焦在非脂質(zhì)體的聚合物上，以尋找更高效低毒，同時(shí)對(duì)研究影響較小的轉(zhuǎn)染試劑。

LeapWal PolyShooter 轉(zhuǎn)染試劑，即PolyShooter Transfection Reagent是一種基于陽離子高分子聚合物的新型轉(zhuǎn)染試劑，適用于DNA、RNA的轉(zhuǎn)染。其原理為帶正電的高分子聚合物與核酸帶負(fù)電的磷酸基團(tuán)形成帶正電的復(fù)合物后，與細(xì)胞表面帶負(fù)電的蛋白多糖相互作用，并通過內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞，隨后在胞質(zhì)中釋放，實(shí)現(xiàn)外源核酸的細(xì)胞轉(zhuǎn)染。

LeapWal PolyShooter 轉(zhuǎn)染試劑對(duì)多種常見細(xì)胞具有高水平轉(zhuǎn)染效率，具有高效低毒、操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。其*的配方使其可直接加入培養(yǎng)基中，血清的存在不會(huì)影響轉(zhuǎn)染效率，這樣可以減少去除血清對(duì)細(xì)胞的損傷。同時(shí)，轉(zhuǎn)染后不需要除去PolyShooter Transfection Reagent-核酸復(fù)合物或更換新鮮培養(yǎng)基，也可根據(jù)具體情況優(yōu)化轉(zhuǎn)染體系。

02/產(chǎn)品組分

03/保存條件

冰袋（wet ice）運(yùn)輸。4℃保存，有效期6個(gè)月。-30℃至-10℃保存，有效期12個(gè)月，避免反復(fù)凍融。

04/產(chǎn)品特點(diǎn)

優(yōu)秀的轉(zhuǎn)染效率——針對(duì)廣泛類型的細(xì)胞，均表現(xiàn)出優(yōu)秀的轉(zhuǎn)染效率和高重組蛋白表達(dá)水平

細(xì)胞毒性低——作用溫和，能較好地實(shí)現(xiàn)高轉(zhuǎn)染效率與低細(xì)胞毒性之間的平衡

操作簡(jiǎn)單——在血清存在時(shí)亦具有可靠的轉(zhuǎn)染效率，轉(zhuǎn)染后無需去除復(fù)合物或更換新鮮培養(yǎng)基

高性價(jià)比——經(jīng)濟(jì)的價(jià)格，同時(shí)實(shí)現(xiàn)高效的轉(zhuǎn)染效果

05/適用范圍

PolyShooter Transfection Reagent采用陽離子高分子聚合物為主要成分，適用于DNA、RNA的轉(zhuǎn)染。

06/實(shí)驗(yàn)流程概要

07/實(shí)驗(yàn)步驟（以24孔板為例，其他培養(yǎng)板加樣體積參考表一：轉(zhuǎn)染量度標(biāo)準(zhǔn)）

1: 準(zhǔn)備待轉(zhuǎn)染細(xì)胞

貼壁細(xì)胞：轉(zhuǎn)染前一天，將消化后的細(xì)胞按照每孔0.3-2x105個(gè)細(xì)胞的量進(jìn)行鋪板，使其在轉(zhuǎn)染時(shí)密度為50%-60%。

懸浮細(xì)胞：轉(zhuǎn)染當(dāng)天，配制轉(zhuǎn)染試劑-核酸復(fù)合物之前，在24孔板中進(jìn)行細(xì)胞鋪板，每500 µL生長培養(yǎng)基中加入2-5x105個(gè)細(xì)胞。

? 細(xì)胞狀態(tài)會(huì)極大影響轉(zhuǎn)染效率，待轉(zhuǎn)染細(xì)胞應(yīng)處于良好生長狀態(tài)，建議使用生長處于指數(shù)期、存活率大于90% 的細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

2: 準(zhǔn)備PolyShooter轉(zhuǎn)染試劑-核酸復(fù)合物

（1）取1 μg質(zhì)粒加入到1.5 mL離心管中，加入2.5 μL* PolyShooter 轉(zhuǎn)染試劑與質(zhì)粒混合，室溫孵育3分鐘。

? * 轉(zhuǎn)染試劑使用量受細(xì)胞類型及其他實(shí)驗(yàn)條件影響，通常情況下，DNA（μg）和 PolyShooter轉(zhuǎn)染試劑（μL）的用量比例為1：2.5。建議初次使用時(shí)，可在1：2-1：5的范圍內(nèi)調(diào)整以優(yōu)化轉(zhuǎn)染效果。

（2）往上述混合物中加入100 μL無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基（與培養(yǎng)體系一致，且無血清無雙抗），輕輕混勻，在室溫下靜置30分鐘，形成PolyShooter轉(zhuǎn)染試劑-核酸復(fù)合物。

? PolyShooterTM轉(zhuǎn)染試劑-核酸復(fù)合物在室溫下4個(gè)小時(shí)內(nèi)保持穩(wěn)定。

3: 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

給細(xì)胞更換新鮮的預(yù)熱的*培養(yǎng)基500 μL/孔，將上述100 µL PolyShooter 轉(zhuǎn)染試劑-核酸復(fù)合物加入每孔細(xì)胞，輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)板混勻。

? 對(duì)于懸浮細(xì)胞系：轉(zhuǎn)染5小時(shí)后，可選擇加入PMA和/或PHA以提高CVM啟動(dòng)子的活性并促進(jìn)基因表達(dá)。對(duì)于Jurkat細(xì)胞，PHA和PMA的終濃度分別為1 µg/mL和50 ng/mL，可以提高CMV啟動(dòng)子活性和基因表達(dá)。對(duì)于K562細(xì)胞，只加入PMA足以提高啟動(dòng)子活性。

4. 分析轉(zhuǎn)染細(xì)胞

轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)24-48小時(shí)后，可根據(jù)實(shí)際情況用熒光檢測(cè)法、Western Blot、RT-PCR、ELISA、流式細(xì)胞術(shù)、報(bào)告基因等檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果，或加入篩選藥物進(jìn)行穩(wěn)定細(xì)胞株的篩選。

08/注意事項(xiàng)

1. 核酸質(zhì)量：想要獲得最高的轉(zhuǎn)染效率和更低的細(xì)胞毒性，應(yīng)選用高純度、無菌、無污染、無內(nèi)毒素的優(yōu)質(zhì)核酸。質(zhì)粒中的內(nèi)毒素是轉(zhuǎn)染的大敵，內(nèi)毒素會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率顯著下降，特別是對(duì)內(nèi)毒素敏感的細(xì)胞，例如原代細(xì)胞、懸浮細(xì)胞、造血細(xì)胞等。推薦使用無內(nèi)毒素質(zhì)粒抽提試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒提取，保證質(zhì)粒A260/A280比值為1.8-2.0。同時(shí)，需合理計(jì)算質(zhì)粒用量，轉(zhuǎn)染過量的質(zhì)粒可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞毒性甚至死亡；

2. 細(xì)胞質(zhì)量：細(xì)胞狀態(tài)會(huì)極大影響轉(zhuǎn)染效率，建議使用生長處于指數(shù)期、存活率大于90%的細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染；

3. 細(xì)胞密度：建議細(xì)胞傳代后12-24 h內(nèi)、細(xì)胞密度為50%-60% 時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。不同的細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，對(duì)細(xì)胞密度的要求不盡相同。在進(jìn)行不同核酸或不同細(xì)胞系的轉(zhuǎn)染時(shí)，需要根據(jù)說明書再次優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件。此外，在實(shí)驗(yàn)過程中保證相同的接種條件，確保實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可重復(fù)性；

4. 質(zhì)粒與轉(zhuǎn)染試劑使用比例：對(duì)于大多數(shù)細(xì)胞系，轉(zhuǎn)染復(fù)合物中DNA (μg)與PolyShooter Transfection Reagent (μL) 的比例在1：2至1：5之間，推薦比例為1:2.5。想要獲得*的轉(zhuǎn)染結(jié)果，需要對(duì)這一比例進(jìn)行優(yōu)化，根據(jù)所轉(zhuǎn)染細(xì)胞及質(zhì)粒選擇適合的轉(zhuǎn)染比例；

5. PolyShooter Transfection Reagent可用于有血清培養(yǎng)基的轉(zhuǎn)染，并且轉(zhuǎn)染前后不需要換培養(yǎng)基。但是，制備轉(zhuǎn)染復(fù)合物時(shí)要求用無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基稀釋DNA和轉(zhuǎn)染試劑，因?yàn)檠鍟?huì)影響復(fù)合物的形成；

6. 由于一些特殊培養(yǎng)基中的某些成分可能會(huì)抑制陽離子聚合物介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，因此有必要檢測(cè)特殊培養(yǎng)基與PolyShooter Transfection Reagent的相容性；

7. 為了您的健康安全，請(qǐng)規(guī)范操作，穿戴實(shí)驗(yàn)服與手套開展實(shí)驗(yàn)；

8. 本產(chǎn)品僅供科研使用，請(qǐng)勿用于臨床診斷及治療。

09/實(shí)驗(yàn)案例分析

1: 轉(zhuǎn)染前一天，將圖2所示9種狀態(tài)良好的細(xì)胞接種于24孔板，使其在轉(zhuǎn)染時(shí)密度約為50%。

2: 按照每孔計(jì)量，取1μg GFP質(zhì)粒加入到1.5 mL離心管中，加入2.5 μL PolyShooter Transfection Reagent與質(zhì)粒混合，室溫孵育3 min后，往混合物中加入100 μL無血清基礎(chǔ)DMEM培養(yǎng)基，輕輕混勻，在室溫下靜置30 min，形成PolyShooter轉(zhuǎn)染試劑-核酸復(fù)合物。

3: 給細(xì)胞更換新鮮的預(yù)熱的*培養(yǎng)基500 μL/孔，將上述100 µL PolyShooter 轉(zhuǎn)染試劑-核酸復(fù)合物加入每孔細(xì)胞，輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)板混勻。

4：轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)48小時(shí)后，用熒光顯微鏡檢測(cè)GFP綠色熒光蛋白表達(dá)情況，并拍照記錄，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。

圖2: 轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)48小時(shí)后，用熒光顯微鏡檢測(cè)GFP綠色熒光蛋白表達(dá)情況

10/其他相關(guān)產(chǎn)品